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黃曲霉毒素B1免疫親和柱操作說明書
【概要】
黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產生的次級代謝產物，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構劃分為1類致癌物，同時又是一種毒性極強的劇毒物質，廣泛存在于各種食物中。玉米，花生，大米，小麥等谷物及其副產品是黃曲霉毒素的主要來源，同時飼料中的黃曲霉毒素B1經過動物代謝后產生的黃曲霉毒素M1仍然具有很強的毒性和致癌性，也廣泛存在牛奶，血液，組織等食品中。黃曲霉毒素作為肝癌的三大誘因之一，也是誘發(fā)胃癌，腸癌等疾病的主要原因之一，對人類的健康構成很大威脅。世界各國對食品，飼料中的黃曲霉毒素都有嚴格的限量標準。
【適用范圍及性能】
用于定性、定量檢測谷物、副食品、酒類等食品和飼料等樣本中的黃曲霉毒素總量B1時的樣品前處理。
柱容量：≥200ng
回收率：≥90%
【試驗原理】
本產品的測定的基礎是抗原抗體反應，黃曲霉毒素B1單克隆抗體連接在柱內凝膠上，樣品中的黃曲霉毒素B1經過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢的通過黃曲霉毒素B1免疫親和層析柱，在免疫親和柱內，毒素與抗體結合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結合的其他物質。用甲醇洗脫黃曲霉毒素B1，然后注入到分析儀器中用于檢測。
【包裝組成】
根據(jù)不同規(guī)格，每一個盒中包含5-25支黃曲霉毒素免疫親和層析柱及1份說明書。
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅高速均質器或組織勻漿機
┅┅粉碎機
┅┅200ml/50ml量筒
┅┅天平：感量0.1g
┅┅微量移液器：單道 100?l～1000?l
┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）
┅┅玻璃微纖維濾紙（1.5?m孔徑）
┅┅50ml漏斗
┅┅一次性玻璃試管
┅┅泵流操作架（包括空氣泵，不同容積的玻璃注射器等）
試劑：
┅┅甲醇（色譜級）
┅┅蒸餾水或去離子水
┅┅pH7.0磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL
┅┅吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000mL
【試劑配制】
樣品提取液：根據(jù)不同的樣品配置不同濃度的甲醇水溶液，作為樣品提取液。
【樣本處理步驟】
（一）花生，玉米，大米，小麥及其制品，植物油脂和飼料
┅┅取25g粉碎的樣品（植物油脂直接取樣，無需處理）與125mL甲醇-水（7：3）溶液混合；
┅┅加入5.0g氯化鈉以均質器高速攪拌，提取2分鐘；
┅┅4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；
┅┅取15mL濾液并加入30mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾，取稀釋后液體待測；
┅┅將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確移取15.0mL樣品提取液注入玻璃注射器；
┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；
┅┅以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體；
┅┅準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
（二）醬油
┅┅取50g試樣與100mL甲醇-水（8：2）溶液混合；
┅┅加入2.5g氯化鈉以均質器高速攪拌，提取1分鐘；
┅┅4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；
┅┅取10mL濾液并加入40mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾
┅┅取稀釋后液體待測；
┅┅將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL樣品提取液注入玻璃注射器；
┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；
┅┅用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體；
┅┅準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
（三）食醋
┅┅取5g試樣，加入1.0g氯化鈉；
┅┅以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋定容至25.0mL；
┅┅4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；
┅┅取10mL濾液并加入10mL水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過濾
┅┅取稀釋后液體待測。
┅┅將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL樣品提取液注入玻璃注射器；
┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；
┅┅用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體；
┅┅準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
【結果判定】
經免疫親和柱凈化后，收集到的甲醇洗脫液可直接使用熒光計或者HPLC檢測，也可使用薄層色譜或者酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測。收集到的1mL洗脫液中的黃曲霉毒素B1含量相當于1g樣品中黃曲霉毒素B1含量。
【高效液相參考譜圖】
【注意事項】
┅┅黃曲霉毒素危害極大，應戴手套操作。
┅┅使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液最好用5%濃度次氯酸鈉溶液浸泡過夜。
┅┅不要使用過了有效日期的免疫親和柱。
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：親和柱可于常溫保存，2-8℃儲存可延長有效期，不可凍存
保存期：該產品有效期為12個月。
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